共振纳米光子生物传感器的制作方法

1.本发明涉及光学生物传感器。


背景技术：

2.核酸、蛋白质、小分子和全病原体测试对于生物体和生态系统健康的预测、检测、监测和治疗是关键的。例如，呼吸面板识别指示如流感和冠状病毒的传染病的抗原、抗体、核酸和全病原体特征；核酸和循环肿瘤细胞标识癌症并且被用于指导治疗；并且在环境样品中发现的核酸和小分子指示海洋、淡水、牲畜、土壤和空气的健康状况。最常见的是，使用诸如逆转录酶聚合酶链反应(reverse-transcriptase polymerase chain reaction，rt-pcr)、分子信标和dna微阵列之类的技术对核酸序列进行标识和分析；同样地，使用elisa或横向流动测定检测蛋白质和小分子。然而，这些技术要么缓慢且敏感(例如，rt-pcr、elisa)，要么快速且不精确(例如，横向流动测定)。用于快速分析患者样品中的生物标记物的、并且可以在护理点工作的新颖的方法是必要的。理想地，这些方法还可以符合世界卫生组织的assured指南(负担得起的、敏感的、特定的、用户友好的、稳健的和快速的、无装备的、对需要它们的人是可递送的)。


技术实现要素：

3.我们开发了一种新技术，该技术使用光学表征来快速且定量地测量：1)dna或提取的病毒-rna目标结合、2)抗体结合、3)全病原体(即，全病毒或细菌)结合、和/或4)到纳米制造平台上的小分子结合。
4.我们可以检测从sars-cov-2基因组中提取的用于对不同的蛋白质进行编码的病毒-rna基因序列，不同的蛋白质包括包膜蛋白、rna依赖性rna聚合酶、以及同时形成病毒核衣壳且无需扩增的蛋白质。我们还可以从血清样品中检测抗体，这些抗体包括igg、igm和iga。我们还可以从痰液或唾液中检测全病毒或细菌结合。我们的技术还可以被扩展到covid-19以外的其他病毒或细菌感染，被扩展到类似于癌症、过敏原或神经系统疾病的其他疾病，并且还被扩展到检测农业或环境设置中存在的疾病和毒素。
5.我们的平台依赖于高品质因子(“高q”)纳米结构化介电基板，其称为超表面(metasurface)，生成具有高灵敏度的共振散射强度，该灵敏度与吸附的生物标记物负载成比例。超表面用受体进行功能化，并且暴露于患者样品，以从用例如鼻咽、口腔/粘膜拭子、血清学样品、血液、或唾液/呼吸样品进行病毒感染测试的患者确定对应的病毒负载。
6.随后，超表面用激光或发光二极管来照亮，并且透射或反射的入射光的光学读出提供对核酸、抗体或全病原体目标的定量、灵敏和实时监测，而不需要感兴趣的基因/抗体的逆转录、扩增或标记。我们快速且灵活的抗原和抗体测试技术易于部署、制造并适用于新的传染性病原体。我们的技术承诺检测的极限可与当前的定量rt-pcr和elisa测定相当，速度可与横向流动测定相当。
7.高q超表面设计：
8.我们利用被称为超表面的纳米结构化硅表面来从患者样品中检测目标抗原标记物。超表面用微型、片上激光二极管或发光二极管照亮，并且散射强度提供了片段化病毒rna、抗体或全病原体浓度的定量测量。通过依靠自由空间共振超表面，我们克服了横向流动测定通常较低的信噪比，并促进了使用现成的消费电子级相机传感器。在其他材料上使用纳米图案化硅表面也保证了该测定的可扩展性和成本效益；值得注意的是，它允许我们利用成熟的cmos制造工艺及其独特的大规模、低成本制造优势。
9.2020年11月4日提交的美国专利申请17/089384中考虑了高品质因子(高q)衍射光学超表面，并且通过引用将其全部内容并入本文中。这些超表面包括纳米天线阵列，这些纳米天线阵列可以被设计为同时捕获并由此放大光以及操纵光散射到远场的方式。捕获能力(其是感测的关键)是通过构建由透明、高折射率材料(诸如硅)制成的单个天线来实现的，使得它们支持导模共振(guided mode resonance，gmr)。衍射光谱示出了在近红外波长处可见的急剧下降，其表示gmr。光学共振的寿命由品质因子(q)表征，通过将中心频率除以其光谱宽度来测量。通过仔细调整几何形状，我们可以确保共振在数千个光学周期内捕获光，从而产生入射光强度的等效的倍增。除了在时间上压缩光之外，超表面还将光挤压到非常小的体积中。将这些效应综合起来会产生一种基板，它的散射对抗原核酸片段和抗体的存在响应非常敏感。
10.高q超表面读出：
11.我们的超表面内的高品质因子模式针对敏感目标检测给出了关键的信号放大。因此，我们可以直接地读出散射(透射或反射)的强度。重要的是，由于每个纳米天线都独立于其邻居，因此多重检测是可能的。
12.我们的超表面还可以实现灵敏的拉曼光谱，以用于对全病原体进行特定检测。此处，超表面被设计成在泵浦波长(pump wavelength)处具有高q模式，在斯托克斯偏移波长(stokes-shifted wavelength)处具有更宽的q模式。替代地，可以将一系列高q模式定位在斯托克斯位移波长处，其中病原体的特征可以被预测。
13.最后，我们的超表面本质上是色散的。由于我们的超表面是在操作波长～100-1000nm的尺度上进行设计的，它们可以有效地衍射散射光。在我们先前的实验中，我们证明了我们可以独立于高q超表面共振而系统地调谐该衍射曲线。由于强烈的结构色散，我们可以简单地通过使用ccd或cmos相机对元曲面进行成像来在空间上分离各种散射波长。这种光学色散将揭示关于抗体或病原体的高分辨率光谱信息，而不需要诸如光谱仪和光谱ccd之类的笨重、昂贵的光学组件。
14.用于核酸/抗原检测的超表面功能化：
15.超表面平台的化学功能化依赖于超表面的共价硅烷化，例如，(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(aptms)或11-氨基十一烷基三乙氧基硅烷(autes)。随后，与m-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺(mbs)酯交联的胺-巯基被用于附接与当前rt-pcr测定中使用的基因序列e、n2、orflab和5'utr互补的硫醇化dna探针。通过用三甲氧基(丙基)硅烷(ptms)稀释aptms自组装单分子层，dna探针浓度和表面密度可以被调谐，以用于与rna片段的最高效率杂交。这种经由硅烷化进行充分研究的表面功能化方法已经被我们验证为可重现和可控的寡核苷酸附接。
16.用于抗体测试的超表面功能化：
17.抗体测定的表面功能化目前利用6步骤过程。在反映抗原表面化学的前两个步骤后，我们用两性离子单层聚乙二醇(peg)化基质对表面进行功能化，该基质被优化以用于最小化非特定吸收。该基质由两个分子的优化的比率组成，2-{2-[2-(1-巯基-11-基氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基次氮基三乙酸(hs-c11-(eg)3-nta)和(2-[2-(2-[11-氢硫基-十一烷氧基)-聚氧乙烯]-聚氧乙烯)-聚氧乙烯]-聚氧乙烯)-二甲基铵)醋酸盐，其中的第一个最终会与我们感兴趣的抗体结合，而第二个会增加单层的密度。与氯化镍盐一起的随后的孵育可与nta分子结合。随后，这种ni(ii)-nta复合物使sars-cov-2刺突蛋白的rbd区域能够与我们的超表面结合。刺突蛋白已被多组氨酸标签修饰，这增加了刺突蛋白对金属离子的亲和力，并且从而增加了其与单层ni(ii)-nta复合物的结合亲和力。重要的是，这种功能化定位抗体识别位点，从而允许与我们的初级抗体结合的可能性增加。
[0018]
我们将芯片放置在密封的保持器中，该保持器允许在没有污染的情况下引入液体患者样品(鼻咽拭子以及血清样品)，并同时进行光学询问和读出。
[0019]
显著的优点被提供。与现有的抗原测试相比，我们的测定提供了若干项优势：1)近乎瞬时的读出(我们目前使用30ms采集)；因此，结合样品处理(例如，病毒基因片段化)，我们的测定可以在护理点《15分钟内提供抗原结果。2)由于芯片激光锐散射光谱，检测的极限极低；初步实验指示1000cp/ml的灵敏度。3)通过依靠纳米图案化硅，我们利用建立的高通量cmos制造工艺的低成本和可扩展制造。4)荧光标记或次级抗体不被需要；因此，用户在收到我们的产品后不需要任何试剂。5)由于表面的“自由空间”照明和我们的生物打印功能化，在单个芯片上的大规模多重抗原和抗体测试是可能的。6)我们的基板在清洗后是可重复使用的。7)需要最少的使用培训，不像pcr或elisa需要实验室技术人员或医疗保健专业人员。我们计划在医疗保健系统中拥有庞大的客户群，包括医生/诊所、紧急护理设施和医院；从长远来看，在家进行测试可以被部署。
附图说明
[0020]
图1a-图1c示意性地示出了本发明实施例的若干个操作原理。
[0021]
图2a-图2e示出了高q传感器的设计。
[0022]
图3a-图3c示出了超表面的流体细胞表征。
[0023]
图4a-图4d示出了dna单层功能化和共振波长偏移测量。
[0024]
图5a-图5c示出了使用sars-cov-2基因片段目标的生物感测演示。
[0025]
图6a-图6b示出了凹口的导模共振以及块波导导模共振的电场分布。
[0026]
图7示出了扰动深度对q因子的影响。
[0027]
图8a-图8d示出了波导长度对共振器q的影响。
[0028]
图9a-图9b示出了荧光显微镜结果。
[0029]
图10a-图10f示出了用于蛋白质检测的示例性表面功能化。
[0030]
图11a-图11b示出了由于图10a-图10f的表面功能化、并且由于目标蛋白的结合所引起的共振波长偏移。
具体实施方式
[0031]
a部分描述了与本发明的实施例相关的一般原理。b部分涉及核酸检测的示例。c部
分涉及蛋白检测的示例。
[0032]
a)一般原理
[0033]
图1a-图1c示意性地示出了本发明实施例的若干个操作原理。此处图1a是俯视图，图1b是侧视图，并且图1c是放大图。第一示例性实施例是包括电磁超表面101的装置，该超表面101包括设置在基板102上的一个或多个波导104、106、108等。此处示出了三个波导，但可以部署任何数量的波导(包括单个波导的特殊情况)。一个或多个波导中的每一个波导都支持一种或多种导模。一个或多个波导中的每一个波导都具有对应的纵向扰动，由此至少一个导模共振在一个或多个波导中的每一个波导中被支持。在图1a的示例中，该纵向扰动是图1a所示的宽度变化。此处波导的纵向扰动是破坏波导的潜在平移不变性的任何扰动。此类扰动可以是周期性的或非周期性的，并且可以包括诸如波导结构的凹口、翅片和长度、宽度和/或高度变化的特征。
[0034]
自由空间辐射(例如，来自图1b上的源118的辐射120)通过一个或多个波导的纵向扰动被耦合到导模共振中的所选择的一个或多个导模共振。所选择的一个或多个导模共振具有延伸到电磁超表面之外的电场分布，以提供环境感测。在图1a上，延伸到超表面之外的电场作为具有不同的线图案的110、112、114、116被示意性地示出，这些不同的线图案示意性地指示超表面的这些部分的不同的表面功能化，如下文进一步描述。在像其中波导包括周期性纵向间隙的图1a的情况中，预计此类高场区域存在于所有间隙中，但为了简单起见，在图1a中仅示出了这些中的几个。优选地，所选择的一个或多个导模共振具有0.2或更大的电场能量的自由空间分数(参见b7.1部分)。
[0035]
该装置可以进一步包括光源118，该光源118被配置成用于提供自由空间辐射120(图1b)。该装置可以进一步包括光学检测器126，该光学检测器126被配置成用于从电磁超表面接收输出辐射122。输出辐射可以是反射辐射、透射辐射、散射辐射、衍射辐射、和/或拉曼散射辐射。
[0036]
检测器126可以被配置成用于基于由一个或多个波导引起的色散124来确定输出辐射122的光谱。请注意，在图1b的侧视图中，波导104、106、108等可以充当衍射光栅，这是此类色散可以如何被提供的一个示例。
[0037]
该装置可以进一步包括表面功能化，该表面功能化被设置在电磁超表面上，并且被配置成用于选择性地结合电磁超表面附近的一种或多种分析物。图1c是图1a-图1b的波导104的放大图(旋转四分之一圈)，其中波导块104a和104b在其上具有表面功能化130，并且其中波导块104c和104d在其上具有表面功能化132。为了易于说明，表面功能化仅被示出在波导块的一个表面上，但实际上它通常会存在于波导块的所有表面上。
[0038]
优选地，如图1c中的示例(并且还如图1a更示意性地所示)，超表面的不同部分具有不同的表面功能化。这允许超表面的不同部分选择性地响应于不同的目标。例如，在图1c上，功能化130与目标134匹配，如由结合目标(bound target)138所示。类似地，功能化132与目标136匹配，如由结合目标140所示。
[0039]
这可以被视为将电磁超表面配置为一个或多个传感器像素的阵列，每个传感器像素包括一个或多个波导中的一个波导的对应的部分或全部。此类一个或多个传感器像素的阵列可以是一维或二维的。每像素选择性表面功能化可以被用于提供两种或更多种不同分析物的多重感测。
[0040]
本发明的实践并不严格取决于被检测的分析物的种类。合适的分析物包括但不限于：核酸、蛋白质、小分子、细胞外囊泡和全细胞。
[0041]
优选地，一种或多种分析物的检测灵敏度为10fm或更好，以在不具有先前的分析物扩增步骤的情况下能够实现一种或多种分析物的检测。此处，针对分析物的检测灵敏度是该分析物的最小可检测浓度。这开辟了能够避免昂贵且耗时的分析物扩增过程(诸如pgr)的重要的可能性。当前方法的另一个重要优势是高动态范围。优选地，用于一种或多种分析物的检测的动态范围为10db或更大
[0042]
b)示例1
‑‑
核酸检测
[0043]
bl)介绍
[0044]
遗传筛选方法在生物体和生态系统健康的预测、检测、治疗和监测中实现了显著的进步。例如，呼吸面板识别指示如流感和2019年冠状病毒病(covid-19)的传染病的病原体核酸；组织和液体活检检测癌症基因突变、复发的可能性，以及被用于指导治疗；并且新兴的环境dna传感器监测海洋、淡水、牲畜、土壤和空气的健康状况。当前的遗传筛选方法包括聚合酶链反应(bcr)、下一代测序(ngs)、sanger测序和dna微阵列。每个都利用寡核苷酸扩增，然后通过光学标记来灵敏地检测目标序列。尽管它们在实验室环境中具有巨大的实用性，但将这些筛选方法转化为临床和定点照护应用最终会受到它们对“传统”光学信号转导(吸收和荧光)的依赖的限制。即使使用最好的光学标签，灵敏和特定的读出总体上也只能通过耗时的热循环和/或用于核酸扩增的昂贵的试剂才能实现。
[0045]
不是放大生物分子的浓度，我们假设光可以共振放大以帮助实现致密的、定点照护的生物标记物筛选方法。光子设备强烈地约束和散射光；当用分子探针装饰时，目标分析物结合会由于共振器环境的极化率或折射率的细微变化而改变光学信号。等离子体传感器是最常见的基于亲和力的生物传感器之一，但具有由金属的固有吸收设置的检测的更大的限制；由此引起的低品质因子(q)共振(q～10)会引起小结合信号的较差的微分(其中共振器的感测品质因数(figure of merit，fom)：灵敏度(每个折射率单位(riu)变化的共振波长偏移除以模式的半最大值全宽(fwhm)是ca.1-10riu-1
)。最近，介电纳米天线和基于超表面的传感器已被设计为具有10's-100's的q因子，并且在fom中具有类似的改进。与高q回音壁模式共振器和光子晶体微腔设备不同，这些超表面可以从自由空间照明，并且远场散射可以被容易地控制，这是在基于成像的设备中的传感器的可扩展性和集成中的优势。然而，这些系统通常依赖于由扩展的二维阵列形成的离域共振模式；由此引起的大模态体积减少了对少量目标分子结合的响应。附加地，扩展的阵列的更大占地面积限制了用于多重分析物检测和数据驱动分析的感测元件的密集并入。
[0046]
在这项工作中，我们报告了基于我们实验室开发的高品质因子超表面的新的遗传分析平台。这些超表面包括亚波长纳米天线，这些亚波长纳米天线强烈地将光约束在近场中，同时提供对远场散射的精确控制。我们设计的共振器在2200的缓冲生物介质中表现出平均q’，具有用于灵敏的生物标记物检测的、对周围环境的强大的场穿透。我们示出了我们的传感器的fom为400riu-1
，这与我们的计算模型非常一致，并且显著地大于现有的纳米光子传感器。我们使用与sars-cov-2e和orflab基因序列互补的自组装单层dna探针来功能化我们的共振器。目标核酸片段与表面探针的杂交引起共振波长的快速(《5分钟)变化，具有分别最高94％和96％的灵敏度和特定性。由于高q共振的空间局部化特性，单个感测像素可
以以每平方厘米160000+个特征的密度进行图案化，这有望跨多种生物标记物实现分析物的并行化。
[0047]
b2)可单个地寻址的高q共振器感测平台
[0048]
图1a是该示例的超表面几何结构的俯视图。此处硅波导104、106、108等被设置在基板102上。该示例的纵向扰动是宽度扰动δd。共振器的几何参数为高度(h)＝500nm、do＝600nm、厚度(t)＝160nm、块间距(ay＝330nm)、链间间距(ax＝10pm)，以及δd在30-100nm之间变化。
[0049]
图2a示出了具有δd＝50nm的共振器的模拟电近场增强。图2b示出了用法向入射的线性偏振平面波照明的超表面的模拟交叉偏振传输响应。将响应归一化为扰动共振器的强度最大值。图2c示出了由多个单个监测和调谐的共振器组成的超表面设备的sem显微照片，其中底部图像是顶部图像的指示部分的放大图。图2d示出了来自具有7个共振器的阵列的光谱图像，其中c表示没有扰动δd＝0nm的纳米结构，并且r1-r5表示具有扰动δd＝50nm。共振位置通过调节模块长度来调制，其中r1和r5的d0＝595nm，r2和r4的d0＝600nm，r3的d0＝605nm。图2e示出了与图2d相对应的行平均透射强度。
[0050]
该传感器设计包括用近红外光照明的硅纳米块的列(或行)。每个列构成一维导模共振(gmr)超表面；每个行内的块宽度的周期性调制(由δd表征)允许有限但抑制的偶极辐射以及被耦合到以其他方式的结合波导模式的自由空间。由此引起的长共振寿命转化为强电近场增强(图2a)。值得注意的是，硅块表面处的电场增强了80倍。由于共振器内离散硅块之间的间隙，29％的电场能量被暴露在周围介质中，而相比于在连续或部分凹口的波导中，8％的电场能量被暴露在周围介质中(另请参见b7.1部分和图6a-6b)。间隙中的这种场集中引起对表面界限分析物的更高的灵敏度。附加地，这些硅共振器在远场中表现出尖锐的散射响应。如图2b中被看出，对于δd＝50nm，计算的透射光谱q因子超过5000，并且可以随着d的降低而进一步增加(参见下文)。
[0051]
我们在蓝宝石基板(图2c)上制造硅共振器(参见b8部分)。利用配备近红外超连续谱激光器和光谱仪的透射显微镜，我们以法向入射照明超表面并且同时测量来自多个共振器的透射光谱(图2d)。通过将相邻纳米结构中的块长度调制
±
5nm，我们有意改变共振模式的光谱位置，强调每个波导结构都可以作为不同的共振器被单个地寻址和调谐(图2d-图e)；换句话说，我们的高q共振不依赖于链间耦合或扩展的2d阵列效应。光学模式的这种空间定位使我们的平台在理想上适合于密集分布和多重的传感器阵列的集成。
[0052]
b3)导模共振超表面表征
[0053]
图3a-图3c示出了超表面的流体细胞表征。图3a示出了来自具有不同的δd的共振器的光谱。实线示出了与洛伦兹振荡器的拟合。图3b示出了具有不同的δd的共振的品质因子。粗体标记物和误差条是每个状况下n＝30个共振器的平均值和标准偏差。星号表示模拟值，并且虚线与耦合的模式理论(b7.2部分)的预测值相吻合。图3c示出了作为共振器间距的函数的品质因子，其中平均值和标准偏差是针对每个状况下n＝5的共振器的。
[0054]
我们的超表面被密封在3d打印流体细胞中，并在磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液(lx浓度)中表征，以表示生物分子检测的生理状况。在图3a中，我们沿区块链，从δd＝100nm到δd＝30nm改变扰动δd，并且观察到每种状况下25-30个单个共振器的共振线宽的减小。重要的是，在我们的高q超表面设计中，自由空间辐射与gmr之间的耦合强度由沿波导的不对称
的程度来规定。由于硅在近红外中是无损耗的，因此辐射损耗决定了gmr共振寿命和q因子。由此，缩小δd我们观察到具有平均q因子为800(在δd＝100nm时)的散射响应在δd＝30nm时增加到2200，甚至观察到单个共振器的q值超过3000(图3a)。与报道的等离子体生物传感器相比，这些q因子表示两到三个数量级的增加；并且与其他超表面生物传感器相比，这些q因子表示显著的增加(》5倍)，产生约400的fom。由于由制造缺陷引起的散射损失，我们的实验值可能受到限制。我们还注意到水在1500nm波长范围内具有不可忽略的吸收，这可能会限制我们可达到的实验q因子(b7.2部分和图7)。在生物介质的光学透明窗口(诸如1300nm)中设计未来的超表面共振并优化制造工艺可以进一步改进性能，具有潜在地可达到数百万的q因子；我们的超表面的未来迭代可以提供高q微腔的单个粒子灵敏度，但具有由自由空间耦合提供的易于集成和致密性。
[0055]
由于沿每一个单个行的模式的定位，共振器可以被横向间隔至少接近3μm而不影响gmr(图3c)。基于我们制造的200μm的波导长度，我们的设备特征化具有密度超过160000个传感器/cm2的传感器阵列。由于gmr的较慢的组速度，由于有限大小效应引起的损失可以被抑制，并且具有相当的q的50μm波导可以被制造(图8a-图8d)，产生超过600000个传感器/cm2的特征密度。这些大传感器密度提供了用于诊断研究中的稳健统计分析的途径，并且提供了用于并行的许多不同的生物标记物的多重检测的平台。
[0056]
b4)自组装单层功能化和感测
[0057]
图4a-图4d示出了dna单层功能化和共振波长偏移测量。图4a是用于将dna自组装单层(sam)固定到硅纳米结构上的化学组分的示意图。本研究的目标dna片段是来自sarscov-2病毒的e和orf1基因的一部分。图4b和图4c分别示出了实验测得的和模拟的、具有在sam中添加的每个分子层的共振波长偏移响应，包括互补的ncov.e目标结合。实线示出了与洛伦兹振荡器的拟合。实验与模拟光谱之间的绝对波长值的差异可归因于制造结构中的微小尺寸变化。图4d示出了从裸硅结构的初始测量中参考的sam功能化和dna感测期间的总共振波长偏移。标记物表示来自n＝75个独立共振器设备的单个测量，并且粗体标记物和误差条是测量的平均值和标准偏差。
[0058]
为了利用我们的传感器阵列进行基因检测，我们用dna单层修饰了硅表面，其中互补的核酸序列用作特定目标的捕获分子。自组装单层(sam)通过三步骤过程沉积，以在整个超表面芯片表面共价连接26个碱基对单链(ssdna)dna探针。硅表面首先用胺基硅烷(11-氨基十一烷基三乙氧基硅烷，autes)进行功能化，并且随后经由异双功能分子(3-马来酰亚胺基苯甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯，mbs)与硫醇化ssdna探针交联(b8部分)。在这项研究中，我们考虑了sars-cov-2病毒的包膜(e)和开放阅读框lb(orflb)基因的核酸片段目标(genbank登记号：mt123293.2位置分别为26326
→
26351和18843
→
18866)(图4a)。在图4a上，表面功能化的autes、mbs和探针层分别被引用为402、404和406。目标被引用为408。
[0059]
作为原理证明，我们使用合成dna目标，但请注意，病毒rna将类似地与互补dna探针杂交。在图4b中，随着autes、mbs和探针dna的连续分子单层被移植到共振器表面，测得的光谱示出了清晰的共振波长偏移。单层被建模为围绕硅块的薄介电壳，并且模拟响应示出了与实验共振偏移的紧密的一致(图4c)。添加目标sars-cov-2基因后，观察到明显的0.4nm共振偏移(图4d)。数据从n＝75个共振器中被收集，并且我们注意到，与其中信号在更大的2d阵列上进行平均的典型的光子传感器相比，我们芯片上的高密度的感测元件可以实现测
量通量的显著的提高。autes和mbs层的实验与模拟波长偏移之间的偏差可能是由于氨基硅烷分子形成多层结构的倾向性；dna探针的附接以及随后的目标杂交的差异可能是由于空间位阻和静电排斥效应对dna链的堆积密度和杂交效率的强烈影响。
[0060]
b5)快速以及特定基因片段检测
[0061]
图5a-图5c示出了使用sars-cov-2基因片段目标的生物感测演示。图5a示出了测得的光谱，其指示互补dna结合的显著的波长偏移(左)和引入非互补序列时的最小信号变化(右)。
[0062]
图5b示出了对于在仅用ncov.e互补探针进行功能化的超表面设备上孵育的ncov.e和hku.orf1目标两者的浓度依赖性结合响应。误差条指示对于每个目标和浓度状况、来自不同共振器的n＝50-75个测量的标准偏差。虚线示出了对hill等式的拟合。图5b示出了单向anova和事后tukey的hsd测试证实了对于ncov.e和hku.orf1目标的结合响应在统计学上的显著差异。标记物表示平均值，并且条表示99％的置信区间。***p《0.002相比于非互补目标。图5c示出了用100nm的ncov.e目标孵育的6个共振器的动力学结合响应。实线是实验测量的平均值。
[0063]
将我们的共振器与特定的探针dna序列配对提供了目标基因检测中的特异性。为了确认特异性，我们用atto590荧光标记修饰目标dna链(图9a)，并且孵育用仅与ncov.e序列互补的探针进行功能化的传感器。暴露于目标ncov.e和hku.orf1的10m溶液的传感器的荧光成像示出了仅对于互补e基因目标的显著的结合以及非互补orf1链的最小信号(图9b)。该目标特异性也在共振器散射光谱中被测量，其中共振波长偏移对于互补目标探针状况是显著的，并且对于非特定结合是被抑制的(图5a)。我们的传感器表现出从1μm到10nm的浓度依赖性响应(图5b)。在每个目标和浓度状况下对n＝50-75个单个共振器进行测量。每个浓度下共振波长偏移的巨大可变性可能是由于表面结合的随机性；值得注意的是，来自任何特定共振器的信号将取决于结合目标的局部浓度和空间位置(并且因此在具有最大电场集中的位点结合将产生更大的共振偏移)。附加地，在功能化和杂交实验期间，信号变化也可能通过水性溶液中硅烷层的水解降解被引入。我们期望表面功能化的均匀性和稳定性的优化，以急剧地改善我们的传感器的性能。重要的是，我们自信的是这种背景信号(目前是限制我们的分辨率的主要因素)完全来自感测环境的不稳定性，而不是来自光子共振器本身。我们最终期望我们的检测阈值受到共振线宽的限制，具有容易测量的《0.1*fwhm的偏移。我们注意到，在我们的超表面芯片上，硅烷连接化学还将非特定地将dna探针功能化到蓝宝石基板的表面氧化物。我们估计只有0.0003％的表面结合目标分子有助于每个共振器的共振偏移。由此，我们的检测限制在其中只有共振器区域暴露于目标分子的引入微流体通道、利用硅特定的表面功能化过程、或结合附加的纳米结构来将共振器彼此隔离并且进一步增加传感器密度的情况下可以从10nm降低到10fm。附加地，我们的设备的浓度依赖性范围可以通过修改表面探针密度潜在地调谐到不同的分析物浓度值。
[0064]
双向方差分析(anova)和事后tukey的范围测试指示，在所有测试的浓度下，互补目标相对应非互补目标的分散偏移信号中的差异在统计学上是不同的(图5b插图)。我们的平台的增加的测量通量和更大的样品大小可以被用于显著地改进诊断研究的准确性，其中多个测量冗余允许样品群体的改进的量化和分类。例如，我们可以基于阈值共振波长偏移信号，在每个浓度下将“正”互补目标检测与“负”非互补目标检测进行分类。改变阈值信号
产生接受者操作特征(receiver operating characteristic，roc)曲线，并且正信号区分和负信号区分被量化为roc曲线下的面积(aug)。从这个分析中，我们的传感器表现出最高0.98的aug值(其中aug＝1指示完美的信号区分，并且0.5表示无区分)以及分别为94％和96％的高灵敏度和特异性。这种目标基因结合的增加的数字化也可以与基于机器学习的分析进行配对，以用于进一步改进准确性或允许用于区分由于遗传变异和点突变引起的小信号。
[0065]
共振器的实时测量示出了对跨六个表示性共振器上测得的100nm的ncov.e互补目标溶液的快速目标结合响应(图5c)。大于测量噪声的共振波长的变化在几秒钟内被检测到，并且结合信号平台在样品引入的5分钟内被检测到。信号响应示出了具有观察到的杂交速率常数为7x10-3 s-1
的、与其他杂交捕获测定相当的、与langmuir吸收模型(实线图5c)的优秀的一致性。这些快速结合动力学强调了基于芯片的方法相对于需要时间密集型序列扩增循环的常规检测技术的关键优势。
[0066]
b6)结论
[0067]
我们的纳米光子设备提供了用于高通量分子分析的新的平台。我们已经演示了在生理介质(2200+)中具有高q共振的自由空间照明的共振器，可以在超过160000像素/cm2的密度下进行图案化、调谐和测量。在具有用于减少从结构不均匀性引起的散射损耗的改进的制造工艺、从生物介质的减少的吸收损耗、以及用于在共振器链被截断到50m以下时抑制光泄漏的包括光子镜元件的我们的平台中，更大的q和更大的特征密度是可达到的。我们的超表面设计对dna探针提供接口，实现快速、无标记以及高度数字化的遗传筛选，这可以弥补由常规遗传分析技术面临的挑战中的许多挑战。与其中跨不同的感测像素发现不同基因序列探针的生物打印程序进行配对，我们的高q超表面芯片可以为快速、无标记以及大规模多重光子dna微阵列提供基础。此外，我们的纳米光子芯片适用于强度成像和/或高光谱成像技术，在无需光谱仪的情况下提供信号结合信息，从而进一步降低定点照护遗传筛查的复杂性和成本。我们的平台承诺为未来的精准医学、可持续农业和环境恢复力进行大规模和频繁管理的遗传筛查提供独特的可能性。
[0068]
b7)补充信息
[0069]
b7.1)共振器周围电场的空间分布
[0070]
共振模式对局部折射率的微小变化的敏感性可以通过驻留在共振器外部的电场能量的分数来估计。我们使用以下等式来计算传感器中利用的模式的曝光：
[0071][0072]
其中，∈
out
和∈
in
分别是包含分析物的介质的介电常数以及共振器和基板的介电常数。vout和vi表示包含介质的分析物的体积区域以及共振器或基板内部不与任何结合材料或分子重叠的部分。对上文所描述的传感器设计以及先前在具有凹口的硅波导的文献中描述的导模共振结构执行该分析，我们发现我们的硅块链显著地增加了对周围环境的场穿透。
[0073]
图6a示出了蓝宝石基板上的凹口的硅波导的电场分布。上面板示出了通过结构中心的x-y切割，并且下面板是通过场最强烈地集中的凹口扰动中心的x-z切割。图6b示出了
蓝宝石基板上的硅块的不对称链的电场分布。上面板示出了通过结构中心的x-y切割，并且下面板是通过较小的块的x-z切割。比例尺为200nm。
[0074]
凹口结构和块结构的场分布分别被绘制在示出了类似的横向电波导模式的图6a和图6b中。由于我们的传感器中的分立硅块的亚波长间隔，我们仍然激发沿周期性方向的局部化波导模式，这在连续硅线波导中是可见的。然而，类光栅的结构将模式的区域暴露给周围环境，同时还降低了波导的有效模式指数，这导致共振器之外的场的进一步扩展。此设计示例导致周围模式能量的分数增加到f
ue
＝0.29，而相比于凹口波导结构或连续波导结构仅f
ue
＝0.08。将f
ue
称为电场能量的自由空间分数是方便的。
[0075]
b7.2)品质因子缩放和水吸收
[0076]
如上文所讨论的，沿硅波导引入不对称性允许激发先前的结合模式。在我们的超表面的情况下，不对称性的减少、δd降低了模式与自由空间辐射的耦合强度，由此增加q因子。对于没有表现出固有吸收损耗的材料(诸如近红外中的硅)，随着扰动强度接近零，q因子可以被任意地增加。q因子对细微结构偏差的这种依赖性先前已通过时间耦合模式理论和扰动理论进行了描述：
[0077][0078]
其中，b是取决于共振器几何形状的常数，并且a是在我们的超表面中由δd/do表示的无单位的不对称参数。这种关系在图7中被示出，其中理论(实线)和数值模拟(星号)指示随着δd被降低的发散的q因子。我们还观察到实验观察到的q因子低于预测值(来自上述文本的实验数据)。限制我们实验质量因素的一个重要因素是水在电信波长处的吸收系数。由于我们所有的光学测量都是在水性溶液中执行的，因此耗散损耗被预计会降低我们测得的q因子(如由图7中的虚线所示)，它表示包括水吸收率的数值计算。随着δd被降低，吸收损耗的影响尤其地强烈，因为较长的共振寿命会导致共振模式与吸收背景介质之间产生更大的相互作用。我们传感器的未来迭代可以被设计在1300nm周围的水吸收窗口中，以最大化共振器的性能。附加地，超表面结构中的诸如表面粗糙度或不均匀性之类的制造缺陷将引入散射损耗并且降低观察到的q因子。
[0079]
b7.3)有限大小共振器
[0080]
尽管上文示出的共振器在较长的1d阵列(200μm中)表现出高q模式，但我们在此处展示的是，共振器在长度上可以被显著地缩放，同时维持尖锐的光谱特征。我们的超表面设计特征化波导末端的低散射损耗，并且由于分离的硅块与包含背景介质的间隙之间的高折射率对比度而因此对共振器有限大小效应相对稳健。在图8a中，我们示出了三个不同共振器的计算的色散图，这三个不同共振器具有带有增加的凹口波纹深度的实心硅波导(图8a，右)。波导具有600nm的宽度，并且从上到下，波带与具有50、150和300nm的深度的波导的两侧上添加的凹口相对应。当凹口深度被增加到300nm时，我们观察到波带的平坦化，其中波导现在被分开成不同的硅块。由于强烈的面内布拉格散射，较平坦的波带指示小得多的群速度，该群速度减少了模式从波导端传播出去，并且减少了收缩共振器对q因子的影响。我们通过实验验证了我们可以在缩短每个共振器的总长度的同时维持高质量因子。在图8b-图8c中，我们示出了具有从300μm到50μm的不同长度的多个共振器的表示性光谱(图8b)和sem图像(图8c)。为每个状况拟合n＝6个共振器，图8d示出了具有变化的波导长度的q因子
中几乎没有变化。δd＝50和30nm的共振器即使在低至50μm的共振器中也能维持超过1000的高q值。每个共振器都可以潜在地被进一步缩小，在波导端上具有添加的电介质镜，以减少散射损耗。由此，设想具有约为几μm级别的长度的单个自由空间耦合的高q值共振器是可能的。
[0081]
b7.4)荧光显微镜
[0082]
图9a示出了荧光标记的目标dna序列的示意图。图9b示出了暴露于互补ncov.e序列(顶部)和非互补hku.orf1序列(底部)的传感器的荧光图像和集成强度。荧光成像确认了固定化dna探针分子对互补核酸序列的特异性。所有超表面传感器都使用仅与ncov.e序列互补的探针进行功能化。
[0083]
在用5'端上的atto590染料标记的目标核酸进行dna杂交实验后执行荧光实验(图9a)。干燥的样品被放置在蔡司axiolmager系统中，并使用20倍物镜成像。荧光图像是在蔡司axiocam 506单相机上以1000ms的曝光时间采集的。
[0084]
荧光强度值在80x40m面积上取平均，并且被归一化为来自与互补e基因目标杂交的芯片的最大强度值(图9b)。
[0085]
b8)方法
[0086]
b8.1)计算设计
[0087]
使用lumerical fdtd求解器执行电磁模拟。使用x和y方向的周期性边界条件和z方向的完美匹配层(perfectly matched layer，pml)边界条件模拟超表面。用45
°
偏振、并且通过蓝宝石基板从负z方向注射的平面波激发结构。使用放置在+z方向的超表面的远场中的功率监视器计算透射光谱。
[0088]
交叉偏振透射强度被计算为
[0089]
功率(-45
°
)/(功率(-45
°
)+功率(+45
°
))。
[0090]
b8.2)制造
[0091]
超表面是使用标准光刻程序被制造的。首先，500nm、单晶蓝宝石上硅(mti公司)基板在丙酮和异丙醇中经由超声处理被清洁。在用氢倍半硅氧烷(hsq)负色调抗蚀剂(xr-1541-06,corning)旋涂之前，将基板在180℃下烘烤。抗蚀剂在80℃下烘烤40分钟。为了减少充电，电荷耗散层(e-spacer，showa denko)被旋涂在hsq抗蚀剂上，并且在80℃下再次烘烤达5分钟。超表面图案由jeol jbx-6300fs ebl系统中的100kev电子束限定。图案在25％的四甲基氢氧化铵溶液中显影达120秒。使用cl2、hbr和o2化学反应的离子蚀刻将被用于将图案转移到硅层(lam tcp 9400)。hsq抗蚀剂使用2％的氢氟酸水溶液来移除，并且随后样品使用加热至120℃的食人鱼溶液(9:1h2so4:h2o2)来清洁。硅纳米结构通过在炉中在800℃下加热达30分钟来钝化，以生长4nm的氧化物层。
[0092]
b8.3)光学表征
[0093]
共振器光谱在自制的近红外显微镜中被测量。经由具有准直光纤输出的宽带nkt超连续谱激光器对样品进行照明。将偏振器pi设置为相对于超表面结构以45
°
角创建线性偏振入射照明。使用透镜l2(f＝50mm)以获得具有大约200μm的光斑大小的光束通过蓝宝石基板以法向入射微弱地聚焦到样品上。附加地，这项工作中的所有光学测量都是使用在流体细胞中密封并且在pbs ix中浸入的样品芯片进行的。散射光通过50x物镜(奥林巴斯lcpln50xir)被收集，并且通过45
°
的交叉偏振的偏振器p2被引导以减少基板法布里-珀罗
信号。随后，散射光经由透镜l3(f＝75mm)被聚焦到spr-2300光谱仪(普林斯顿仪器)中。宽带信号经由衍射光栅(600g/mm，闪耀波长600nm，普林斯顿仪器)衍射并且被聚焦到风冷砷化铟镓检测器(nirvana，普林斯顿仪器)上。所有光谱测量均被收集作为三个连续200毫秒采集的平均值。通过将数据与函数拟合来分析光谱特征：
[0094][0095]
其中，t是恒定复杂背景ar+aii与具有共振频率为f0以及半峰全宽为2γ的洛伦兹振荡器之间叠加的散射强度。随后，品质因子被计算为q＝f0/2γ。
[0096]
b8.4)表面功能化
[0097]
通过多步骤化学功能化过程，将单链探针dna的自组装单层向硅超表面提供接口。为了激活硅表面以用于功能化，样品被浸入到加热至120℃的食人鱼溶液(9:1h2so4:h2o2)中达20分钟，以使表面羟基化。接下来，样品被浸入到乙醇中的11-氨基十一烷基三乙氧基硅烷(gelest公司)的0.1mm溶液中、被密封、并被放置过夜达18-24小时。样品在新鲜乙醇中被漂洗达5分钟(3x)，并且随后在150℃下烘烤达1小时以形成稳定的硅烷层。通过浸入在1:9(v/v)二甲基亚砜和pbs混合物中溶解达1小时的3-马来酰亚胺基苯甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(密理博西格玛)的1mm的溶液中，将异双功能交联分子附接到硅烷层上达1小时。随后，样品用去离子水彻底漂洗，并且用n2气吹干。单链dna探针从集成dna技术(科拉尔维尔，爱荷华城)获得，在3'端用二硫键进行修饰。将收到的dna探针分散在50μl的ph 8.0tris-edta缓冲液中，并且与30mg dl-二硫苏糖醇混合达至少1小时，以将二硫化物部分还原为硫醇。随后，使用illustra nap-5柱经由重力流大小排阻色谱来纯化探针。使用uv吸收特征(varian cary 500uv-vis分光光度计)来确定洗脱dna溶液的浓度。对于功能化反应，储备溶液的部分随后在具有添加的100mm mgcl2的二价阳离子的pbs 1x中被稀释至20μm。dna探针溶液被移液到每个样品上，并且在黑暗和潮湿的环境中被孵育过夜(约18-24小时)。样品用pbs 1x进行漂洗，并且随后在具有至浓度为1m nacl的添加的盐的pbs溶液中被浸泡达4小时，以移除任何松散结合或物理吸附的寡核苷酸。随后，样品用pbs 1x和去离子水进行漂洗，并且用n2气进行干燥。与图4b和图4d中的光学测量相对应的样品在每个功能化步骤之前和之后被测量，以及在下一个化学处理步骤之前使用附加的去离子水进行漂洗并且用n2进行干燥。与图5a-图5c相对应的样品仅在目标dna杂交之前和之后进行了光学表征。
[0098]
b8.5)dna杂交
[0099]
对于静态dna杂交测量(在上文中排除图5c的所有呈现的数据)，对已用探针dna单层进行功能化的超表面进行基线光谱测量。在所有实验中都使用了具有与sars-cov-2病毒的e基因相对应的序列的探针。在基线测量之后，样品用去离子水进行漂洗并且被干燥。或者与互补e基因相对应或者与非互补orf1b基因片段相对应的目标dna溶液是通过在1xpbs中将100μm储备溶液稀释至期望的浓度而产生的。与100mm mgcl2相对应的附加的二价阳离子被添加到溶液中以提高杂交效率和速度。随后，100μl目标溶液被滴加到每个样品芯片上，并且在黑暗环境中被孵育达30分钟。在最终光学表征之前，样品在pbs 1x和去离子水中进行漂洗。
[0100]
对于图5c中呈现的动态dna杂交测量，用dna探针进行功能化的样品被放置在流体细胞中，并且被安装在上文所描述的光学传输设置中。光谱采集以10秒的间隔被收集，并且
cov-2刺突糖蛋白s1抗体cr3022)一起孵育。抗体溶液在1x pbs中被稀释至5ug/ml的最终浓度。随后，样品被放入1ml溶液中，被密封，并且在室温下孵育达1小时。随后，样品用1x pbs彻底进行漂洗，并且最终样品测量被收集。参见图10f。此处1016是目标抗体，1014是探针蛋白，并且1012是sam。
[0109]
与图11a-图11b中进行的光学测量相对应的样品在每个功能化步骤之前和之后被测量。当芯片被浸入1x pbs中时进行所有测量。对于除了存在蛋白质的步骤(蛋白质探针和目标抗体样品)之外的所有步骤，在进行测量之后和随后的孵育步骤之前，芯片用去离子水进行漂洗并且用氩气干燥。在与探针蛋白质分子孵育之后，样品保持浸入在1x pbs中并且在1x pbs中进行漂洗以避免样品干燥和蛋白质变性。
[0110]
图11a示出了在每个功能化步骤之后测得的光谱偏移。该图示出了在autes、mbs、硫醇化peg-nta、ni(ii)、探针蛋白和抗体样品的连续分子单层层叠在共振器表面上时的清晰的共振波长偏移。
[0111]
图11b示出了具有从n＝15个共振器收集的数据的、硅芯片和最终抗体样品之间的最终偏移。