一种碱式氯化锰及其在NK92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强上的应用的制作方法

一种碱式氯化锰及其在nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强上的应用
技术领域
1.本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种碱式氯化锰及其在nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强上的应用。


背景技术：

2.nk-92(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞)，别称nk92、natural killer-92、nk-92.05、neukoplast、ank。nk-92细胞是从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁男性外周血单核细胞衍生来的一株il-2依赖型nk细胞株。nk-92细胞对很多恶性细胞有细胞毒性；铬释放试验显示它能杀死k562细胞和daudi细胞。nk-92细胞(经过照射以防止增殖)可以有效地用于血液中白血病的体外免疫清扫而不危及血细胞的功能。nk-92细胞有以下特征：cd2、cd7、cd11a、cd28、cd45、cd54表面标记阳性；cd1、cd3、cd4、cd5、cd8、cd10、cd14、cd16、cd19、cd20、cd23、cd34和hla-dr表面标记阴性。
3.锰是精氨酸酶、脯氨酸酶、rna聚合酶、含锰超氧化物歧化酶(mn-sod)、丙酮酸羧化酶等的组成成分，也是体内许多酶如磷酸化酶、醛缩酶、转移酶类、水解酶类的激活因子。
4.羟基氯化物的种类繁多，常见的比例有mnohcl和mn2(oh)3cl，常见的金属阳离子有mg、ni、cu、zn、mn、al、cd、hg等。碱式氯化锰，又称为羟基氯化锰，合成该化合物的方法多为水热法、溶剂热法、液氨法等。
5.申请人长期对制备碱式氯化锰开展研究，例如中国专利申请号201710274851.9，公开了一种可用于动物饲料的碱式氯化锰的制备方法，该合成方法是：向密封的反应装置中加入氯化铵溶液，再在搅拌下缓慢加入氧化锰，加热反应液，达到反应温度后恒温反应，反应结束后过滤、洗涤、干燥，得到碱式氯化锰，但该方法需要对尾气进行处理，步骤相对复杂，并且需要控制反应体系的ph值、需要有机溶剂，在反应过程中可能会产生氨气引起爆沸。因此，碱式氯化锰的制备方法还需要进一步改进。
6.又例如中国专利申请号201710274853.8，公开了碱式氯化锰的制备方法，采用锰和氯化锰溶液在密闭惰性气体保护条件下制得碱式氯化锰，该工艺会产生大量碱性废水污染环境，同时需要惰性气体保护增加了对反应设备的要求，无形之中增加了生产成本，同时反应完以后还需要加有机溶剂，有机溶剂的添加在生产中容易着火，这样增加生产过程的危险性。
7.王云山、张金平等人在中国有色金属学报上发表了用氯化铵和氧化锰制备碱式氯化锰的方法，但是该制备方法是在密闭加压的情况下获得的碱式氯化锰，这种工艺由于反应需要加压，对生产的设备要求很高，同时生产过程具有较大的风险，而所得到产品售价低廉，从成本上考虑只能停留在实验室制备阶段或者作为基础研究，不适合作为大规模工业化生产。
8.目前，碱式氯化锰的制备方法仍然存在很多缺点和不足，且鲜有对碱式氯化锰的制备和在细胞上相关应用的报道。


技术实现要素：

9.针对现有技术中碱式氯化锰的制备方法存在的不足，以及缺少对碱式氯化锰在细胞上相关应用的研究，本发明提供了一种碱式氯化锰及其在nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强上的应用，制备得到一种碱式氯化锰，可以增强nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性。
10.本发明的目的通过以下技术方案来实现：
11.一种碱式氯化锰的制备方法，包括如下步骤：
12.1)将氯化铵、氧化锰和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.5-2.5％的二乙二醇乙醚醋酸酯，进行高压反应，所述氯化铵与氧化锰的摩尔比控制为(1.5-3.0):1，所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:(8-10)；高压反应的压力控制在0.5-0.8mpa，反应温度控制在160-200℃，反应时间为1.0-2.0h；
13.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
14.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，得到碱式氯化锰，碱式氯化锰的厚度20-50nm，边长100-500nm。
15.本发明中：
16.步骤1)所述的氯化铵与氧化锰的摩尔比控制为2:1，所述的氯化铵选自质量分数为15％的氯化铵溶液；所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:9。
17.步骤1)中所述高压反应的压力控制在0.5-0.8mpa，控制适当的压力提高反应速度，同时，有利于容器中的水形成蒸汽并进入到产物颗粒中，压力太低，蒸汽不能顺利进入颗粒内部，压力太高，不利于形成颗粒，产物颗粒的粒径减少，降低了产物的性能，优选地，压力控制在0.6、0.7或0.8mpa。
18.步骤2)中所述将高压反应的密闭容器瞬间卸压，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，使反应产物颗粒中的蒸汽瞬间冲出，由于是瞬间卸压，颗粒中中蒸汽位置没有被填充，形成介孔，从而得到高活性，如果卸压时间太长，颗粒中蒸汽不能瞬间溢出，随着反应容器中压力和温度缓慢降低，颗粒中孔洞结构坍塌，得不到高孔隙率。
19.步骤3)所述的真空干燥，真空度为0.04-0.08mpa，温度为80-120℃，真空干燥时间为1-2h。
20.本发明还涉及采用上述一种碱式氯化锰的制备方法得到的碱式氯化锰，碱式氯化锰的厚度20-50nm，边长100-500nm。
21.同时，本发明还涉及上述碱式氯化锰在nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强上的应用。
22.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
23.1、现有技术中碱式氯化锰的制备方法多采用向密闭的陶瓷反应釜中加入氯化铵溶液、表面活性剂(十二烷基硫酸钠)，最后在搅拌下缓慢加入氧化锰，用热蒸汽加热反应液，反应温度达到80℃后恒温反应6h，反应结束后放料压滤，用乙醇与水的体积比为10:1的混合溶液洗涤3次后，进闪蒸干燥，得到碱式氯化锰。现有的制备方法，整个工序的时间较长，在反应过程中可能会产生氨气引起爆沸，整个反应产生的物料是稠状液体，流速较慢，容易粘壁，粘壁后的管道清理也比较麻烦，虽然加入了十二烷基硫酸钠作为表面活性剂，可以防止目标产物颗粒大量团聚的现象，但是得到的是实心的碱式氯化锰。本发明所述的碱
式氯化锰的制备方法，在高压反应时，加入二乙二醇乙醚醋酸酯，其为无色透明的环保溶剂，和其他原料混合后，反应时可以加快物料的流速、减少挂壁，利于反应的进行。
24.2、本发明所述的碱式氯化锰的制备方法，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，使反应产物颗粒中的蒸汽瞬间冲出，由于是瞬间卸压，颗粒中中蒸汽位置没有被填充，形成介孔，从而得到高孔隙率，如果卸压时间太长，颗粒中蒸汽不能瞬间溢出，随着反应容器中压力和温度缓慢降低，颗粒中孔洞结构坍塌，得不到高孔隙率。
25.3、现有采用结晶生产碱式氯化锰的方法，一般控制所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:(8-10)，加水量太少，氧化锰溶解速度较低，甚至不溶解，会导致反应速率降低；加水量太多，卸压时会影响碱式氯化锰颗粒的的均匀性。本发明所述的碱式氯化锰的制备方法，高压反应后，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，可以保证氯化铵、氧化锰的充分反应，所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:(8-10)比较合适。
26.4、本发明所述的碱式氯化锰在nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强上的应用，制备碱式氯化锰时，在高压反应时，加入二乙二醇乙醚醋酸酯，所制备碱式氯化锰呈现出球状堆积结构，得到的碱式氯化锰厚度20-50nm，边长100-500nm。相比没有加入二乙二醇乙醚醋酸酯得到的碱式氯化锰，团聚现象减弱，并且堆积变得越来越有序；得到的碱式氯化锰，呈现出介孔和大孔结构，这类孔隙的存在将极大地增加碱式氯化锰的比表面积，在应用到nk92细胞中，可以改变nk92细胞的生长微环境，刺激并激活nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强。
附图说明
27.图1是本发明实施例1和实施例2得到的mn2(oh)3cl的红外图谱(上面曲线是实施例1，下面曲线是实施例2)；
28.图2是本发明实施例1制备得到的mn2(oh)3cl的xrd的图；
29.图3是本发明实施例1制备得到的mn2(oh)3cl的xps的图(全谱)；
30.图4是本发明实施例1制备得到的mn2(oh)3cl的xps的图(锰元素)。
具体实施方式
31.以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
32.实施例1：
33.一种碱式氯化锰的制备方法，包括如下步骤：
34.1)将氯化铵、氧化锰和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.5％的二乙二醇乙醚醋酸酯，进行高压反应，所述氯化铵与氧化锰的摩尔比控制为1.5:1，所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:8；高压反应的压力控制在0.8mpa，反应温度控制在200℃，反应时间为1.0h；
35.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
36.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.08mpa，温度为80℃，真空干燥时间为2h，得到碱式氯化锰，碱式氯化锰的厚度20-50nm，边长100-500nm。
37.实施例1得到的目标产物碱式氯化锰经检测，其中氯离子含量为17.6％，锰含量为54.5％，氢氧根含量为25.1％，105℃下易挥发性物质含量为1.6％，该检测结果与碱式氯化锰分子式(mn2(oh)3cl)相符。产品收率为98.2％，产品纯度为98.6％。经xrd检测，产品的xrd图谱(参见图2)中产品图谱与标准图谱相一致。
38.图1是实施例1和实施例2得到的mn2(oh)3cl的红外图谱(上面曲线是实施例1，下面曲线是实施例2)；
39.图2是实施例1制备得到的mn2(oh)3cl的xrd的图；
40.图3是本发明实施例1制备得到的mn2(oh)3cl的xps的图(全谱)；
41.图4是本发明实施例1制备得到的mn2(oh)3cl的xps的图(锰元素)。
42.实施例2：
43.一种碱式氯化锰的制备方法，包括如下步骤：
44.1)将氯化铵、氧化锰和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量2.5％的二乙二醇乙醚醋酸酯，进行高压反应，所述氯化铵与氧化锰的摩尔比控制为3.0:1，所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:10；高压反应的压力控制在0.5mpa，反应温度控制在160℃，反应时间为2.0h；
45.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
46.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.04mpa，温度为120℃，真空干燥时间为1h，得到碱式氯化锰，碱式氯化锰的厚度20-50nm，边长100-500nm。
47.实施例2得到的目标产物碱式氯化锰经检测，产品收率为98.0％，产品纯度为98.5％。
48.实施例3：
49.一种碱式氯化锰的制备方法，包括如下步骤：
50.1)将氯化铵、氧化锰和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量2.0％的二乙二醇乙醚醋酸酯，进行高压反应，所述氯化铵与氧化锰的摩尔比控制为2.0:1，所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:9；高压反应的压力控制在0.6mpa，反应温度控制在180℃，反应时间为1.5h；
51.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
52.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.06mpa，温度为100℃，真空干燥时间为1.5h，得到碱式氯化锰，碱式氯化锰的厚度20-50nm，边长100-500nm。
53.实施例3得到的目标产物碱式氯化锰经检测，产品收率为98.3％，产品纯度为98.4％。
54.实施例4：
55.一种碱式氯化锰的制备方法，包括如下步骤：
56.1)将氯化铵、氧化锰和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.8％的二乙二醇乙醚醋酸酯，进行高压反应，所述氯化铵与氧化锰的摩尔比控制为2.5:1，所述的氯化铵、氧化锰的总质量和去离子水的质量比为1:9；高压反应的压力控制在0.7mpa，反应温度控制在200℃，反应时间为1.0h；
57.2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
58.3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.05mpa，温度为100
℃，真空干燥时间为1.5h，得到碱式氯化锰，碱式氯化锰的厚度20-50nm，边长100-500nm。
59.实施例4得到的目标产物碱式氯化锰经检测，产品收率为98.1％，产品纯度为98.5％。
60.对比例1：
61.现有的一种碱式氯化锰的制备方法，包括以下步骤：
62.向密封的2m3陶瓷反应釜中加入856kg质量分数为15％的氯化铵溶液，再加入1.1kg十二烷基硫酸钠，最后在搅拌下缓慢加入纯度为96％的氧化锰148kg，用热蒸汽加热反应液，反应温度达到80℃后恒温反应6h，反应结束后放料压滤，用乙醇与水的体积比为10:1的混合溶液洗涤3次后，进闪蒸干燥，得到碱式氯化锰191.8kg，以锰计收率为94.8％。
63.对比例2：
64.和实施例1相比，步骤1)中没有加入二乙二醇乙醚醋酸酯，其他同实施例1。
65.对比例2：
66.和实施例1相比，步骤1)中没有加入二乙二醇乙醚醋酸酯，而是加入回转窑渣；
67.所述的回转窑渣，是指以钢铁厂含锌烟尘、渣灰、瓦斯灰、锌湿法冶炼浸出渣等含锌固废为原料，经回转窑火法挥发富集制备次氧化锌的工艺流程中而产生的，通过除杂处理、吸附处理、干燥后，主要成分检测如下所示：cu 5.6％、fe《0.1，余量为c；
68.其他同实施例1。
69.对比例3：
70.和实施例1相比，步骤1)中没有加入二乙二醇乙醚醋酸酯，而是加入十二烷基硫酸钠；
71.其他同实施例1。
72.实验例：
73.碱式氯化锰对于nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性的增强的影响。
74.1、原料制备
75.褐藻多糖：取200mg褐藻多糖于2ml热水中，超声10min，充分溶解，过0.22μm滤膜，制成100mg/ml褐藻多糖储备液，置5℃冰箱备用。
76.文献报道，褐藻多糖主要来自于海带、裙带菜、巨藻、马尾藻、泡叶藻、墨角藻等褐藻，其与一般的多糖类物质不同，褐藻糖胶的部分羟基被硫酸酯化，褐藻多糖与“硫酸基”中间用“酯键”连接，因此，也被称作为“褐藻多糖硫酸酯”。现有研究表明，褐藻多糖具有多种生物活性，如免疫调节、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒等；研究发现，褐藻多糖具有免疫调节作用，能够增强巨噬细胞的吞噬活性、降低脂多糖(lps)诱导细胞分泌一氧化氮(no)。
77.本技术将浓度为0.5mg/ml的褐藻多糖作为样品。
78.2、nk92细胞培养
79.(1)细胞生长特性：悬浮，生长极慢；
80.(2)培养基：90％1640培养基(含双抗)+10～12％ fbs；
81.(3)复苏：37℃水浴，含15％培养基；
82.(4)换液：2天一次，取一半到新瓶，各补加一半培养基，或收集离心(1500r，5min)，再重悬；
83.(5)传代：同换液，传代比例1:2；
84.(6)冻存：90％血清+10％ dmso；
85.(7)注意事项：全过程操作轻缓。
86.3、cck8法测定自然杀伤细胞(nk92细胞)杀伤活性
87.(1)复苏、培养nk92细胞(效应细胞)；
88.(2)复苏、培养hepg2细胞(靶细胞)；
89.(3)分别制成细胞悬液，并检测细胞密度；
90.(4)细胞接种到96孔板，分组：效应细胞孔、靶细胞孔、正常对照孔[又称为效靶细胞孔，效靶比2:1，即效应细胞2
×
104(每孔)、5
×
105(每孔)、靶细胞1
×
104(每孔)]、样品孔(正常对照孔+样品)及空白对照孔(无细胞)。每孔体系200μl，轻微震荡混匀置于细胞培养箱培养24h；
[0091]
(5)培养结束，弃去培养基，每孔加100μl pbs缓冲液清洗两遍，每孔再加含110μl试剂溶液(培养基：cck8试剂＝100:10)，混匀，孵育2h；
[0092]
(6)孵育结束，测od450；
[0093]
(7)按以下公式计算nk细胞杀伤活性：
[0094]
自然杀伤活性(％)＝[1-(效靶细胞孔od值-效应细胞孔od值)/靶细胞孔od值]
×
100％；
[0095]
对照组：样品(浓度为0.5mg/ml的褐藻多糖)；
[0096]
实验组1：样品中添加实施例1得到的碱式氯化锰0.1mg/ml；
[0097]
实验组2：样品中添加实施例1得到的碱式氯化锰0.2mg/ml；
[0098]
实验组3：样品中添加实施例1得到的碱式氯化锰0.3mg/ml；
[0099]
对比组1：样品中添加对比例1的现有常规碱式氯化锰0.1mg/ml；
[0100]
对比组2：样品中添加对比例2得到的碱式氯化锰0.1mg/ml。
[0101]
对比组3：样品中添加对比例3得到的碱式氯化锰0.1mg/ml。
[0102]
nk92细胞主要通过颗粒酶-穿孔素介导的细胞毒性作用对癌细胞具有自然杀伤力，采用cck8法检测肝癌细胞hepg2在不经过和经过nk92细胞处理的存活率，判断nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性。
[0103]
同时部分nk92细胞预先在含不同功效成分的培养基中孵育24h，再测其对hepg2细胞的自然杀伤活性，根据结果判断各个组分对nk92细胞自然杀伤活性的影响。
[0104]
表1经不同处理后nk92细胞自然杀伤活性(％)
[0105]
自然杀伤活性，％对照组37.7实验组143.2实验组245.3实验组348.6对比组138.0对比组240.6对比组340.2
[0106]
1、从表1可以看出，与对照组相比，实验组1-3和对比组2、对比组3的对nk92细胞自
然杀伤活性有提高(43.2-48.6％)，对比组1对nk92细胞自然杀伤活性无影响，说明采用高压处理，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，使反应产物颗粒中的蒸汽瞬间冲出，由于是瞬间卸压，颗粒中中蒸汽位置没有被填充，形成介孔，从而得到高孔隙率，得到的碱式氯化锰能对nk92细胞自然杀伤活性有提高，而对比例1没有采用高压处理，缺少瞬间泄压，得到的碱式氯化锰对nk92细胞自然杀伤活性无影响。
[0107]
2、实验组1-3和对比组2、对比组3相比，实验组1-3对nk92细胞自然杀伤活性的提高明显优于对比组2、对比组3，分析是因为实施例1-3在制备碱式氯化锰时，在高压反应时，加入二乙二醇乙醚醋酸酯，所制备碱式氯化锰呈现出球状堆积结构，得到的碱式氯化锰厚度20-50nm，边长100-500nm。相比没有加入二乙二醇乙醚醋酸酯制备得到的碱式氯化锰，团聚现象减弱，并且堆积变得越来越有序；得到的碱式氯化锰，呈现出介孔和大孔结构，这类孔隙的存在将极大地增加碱式氯化锰的比表面积，在应用到nk92细胞中，可以改变nk92细胞的生长微环境，刺激并激活nk92细胞对肝癌细胞的自然杀伤活性增强。
[0108]
通过实施例和对比例的基本性能的比较，说明实施例的制备方法明显优于对比例。